育种专栏 | 4-基因分型之固相芯片

前沿分享

2022-10-07


前面介绍到基因/SNP分型是现代分子育种的关键

SNP检测又有很多技术和方法

如基因芯片、简化基因组测序、重测序、靶向测序等

一种好的SNP分型方法应该兼顾了通量、成本、稳定性和灵活性等因素

因此小编计划介绍几种目前常见的SNP分型方法

本篇就先从 基因芯片 开始吧。

  基因芯片简介

  首次听到“基因芯片”的外行人很容易将其与工业上集成电路的电子芯片联系起来,实际上它们除了都利用缩微技术使得外观比较像以外,其他没什么关系,纯属碰瓷。基因芯片又称为DNA 芯片、生物芯片或DNA微阵列等,是根据分子间的特异性相互作用的原理,将不连续的分析过程集成于硅或玻璃等固相芯片表面,以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物成分的准确、快速、大量的检测。根据特定的科研应用内容,基因芯片可以细分为微阵列比较基因组杂交( a-CGH) 芯片、microRNA 芯片、SNP芯片、表达谱芯片、DNA甲基化芯片和染色质免疫共沉淀芯片等。

  第一张商业化基因芯片在1996 年诞生。随着生物技术的发展,到目前为止,在生物分子检测和基因型鉴定领域,包含高密度分子标记或探针的生物芯片发挥着巨大作用,已广泛应用于医学检测与诊断、基因组学、遗传学和动植物育种。尤其是医学研究领域已经产生了大量的芯片数据,NCBI的GEO是目前最大的芯片数据库,也成了众多科研人员公共数据挖掘的重要来源。与传统的检测方法相比,基因芯片可以一次性固定数万个探针,从而检测数万个已知序列的相应信息。

  SNP芯片技术就是将第3代SNP标记固定在载体上形成密集的寡核苷酸探针阵列,再与目标DNA 进行等位基因特异性反应,根据反应后信号的有无和强弱确定SNP位点的多态性,该技术可以对作物全基因组实现快速、高密度的扫描,特别是对育种工作中的大量群体样本进行基因型鉴定时,单个检测位点成本很低,是一种高集成、高通量、微型化和自动化的检测SNP的手段。SNP芯片依据自身高通量、自动化和高灵敏度等特点,被学术界和商业科研机构普遍认为具有重大的研究价值,也有很好的产业化趋势。知名商业化公司如ThermoFisher、Agilent、Illumina、Affymetrix(已被ThermoFisher收购,为了更好区分,此处仍以Affymetrix为名)等,其中Illumina的Infinium技术和Affymetrix的Axiom技术应该是目前较为流行的高密度SNP芯片解决方案,所以这里重点介绍一下这两项技术。

  Illumina Infinium BeadChip

  Illumina的生物芯片系统主要由芯片、扫描仪和分析软件组成。而芯片则由玻璃基片和微珠两部分组成。

  Illumina Infinium芯片是基于微珠的 BeadArray生物芯片,首先在玻璃基片(称为Wafer)上,通过光蚀刻的方法蚀刻出许多个排列整齐的小孔,每个小孔直径约为3 μm,这些小孔刚好可以容纳一个微珠。微珠是芯片的核心部分,每个微珠的表面偶联了几十万条相同序列的DNA 片段。这些DNA片段的长度是73个碱基,分成2个功能区域,靠近珠子一侧的23 个碱基的序列被称为Address 序列,是标识微珠的标签序列,相当于微珠的身份证号码(ID 号);远离珠子端的50 个碱基被称为探针序列,是针对某一个特定的SNP 位点设计的,作用是与目标DNA 进行互补杂交。Address 序列与探针序列之间是一一对应的关系。

  在Illumina 芯片生产过程中,把几十万种微珠按设定的比例混合好,撒到玻璃基片上,微珠随机落入基片的小孔中,通过检测微珠上DNA 片段单碱基延伸时所掺入的dNTP 上所带的荧光信号来区别不同的基因型。

 

  图片说明:

  A:在玻璃基片上光蚀刻出直径约为3 μm 的整齐小孔,每个小孔刚好可以容纳一个微珠;

  B:微珠表面偶联了几十万条相同序列的DNA 片段,靠近珠子一侧的23nt 序列是用于标识微珠的Address 序列,而远离珠子端的50nt 序列是待测SNP 位点特异性的探针序列;

  C:用绿色荧光标记C 碱基,用红色荧光标记T 碱基,以基因型为CT 的SNP 为例,如果发出的光为绿色,则是CC 纯合子,如果发出的光为红色,则为TT 纯合子,如果绿色和红色荧光都有,而且光强度差不多,那么该位点则是CT 杂合子。

  Illumina的SNP芯片具有如下优势:

  检测通量大,一次可以检测几十万到几百万个SNP位点;

  检测准确性高,可以达到99.9%以上;

  检测的费用相对低廉,大约一个90万位点的芯片(每个样本的)检测费用在一两千元。在农作物育种方面,Illumina Infinium BeadChip技术已经设计研发出大量SNP芯片,如水稻6K、玉米50K和3K、小麦9K和90K、大麦的9K等。

  Affymetrix AxiomAffymetrix 公司主要有GeneAtlas、7G、DX2和GeneTitan四种机型,应用最广的两种生物芯片是表达谱芯片和SNP分型芯片。SNP芯片制作也是通过“光蚀刻”完成的,即在一张大的玻璃基片上合成DNA 探针,探针的3′端固定到玻璃基片上,相同序列的探针都是针对同一个SNP 设计的。

  Affymetrix Axiom 分型芯片是基于连接反应进行基因型检测:首先设计4 套显色探针,A、C、G、T 各一组,这些探针长度都是9 个碱基,其中只有3′末端的第1 个碱基是特异的,从第2 个碱基到第9 个碱基都是简并的;3′端是C或G碱基的探针的5′端带有一个生物素标签,最后会被染成红色荧光;3′端是A 或T 碱基的探针的5′端带另外一种标签,最后会被染成绿色荧光。

  以一个基因型为GT 的SNP 位点为例,先设计这个SNP 位点的特异性探针(通过羟基连接在芯片上,也称为“捕获探针”),该探针正好延长到SNP 位点旁边的一个碱基处;当样本DNA 经过变性后,单链DNA 会与捕获探针退火杂交;再加入4 种显色探针,通过连接酶进行连接,因为连接酶对连接位点前后几个碱基进行精确识别,所以只有与目标DNA 片段完全互补的显色探针才会被连接酶连接到捕获探针上去;连接反应完成后,将游离的显色探针洗掉,再用带荧光标记的染色试剂进行染色;最后,在激光扫描仪中对芯片进行扫描,扫描过程中,如果看到该探针上所发出的光是单纯红色,就可以判断这个位点的SNP 型是GG 型纯合子;如果发出的荧光是单纯的绿光,那么就可以判断这个SNP 是TT 型纯合子;如果发出的光,既有红光又有绿光,而且红光和绿光的光强差不多,则可以判断这个SNP 位点是GT 的杂合子。

  图片说明:

  A:在一张大的玻璃基片上直接合成DNA 探针,探针的3′端固定在玻璃基片上;

  B:设计A、T、C、G 4 种碱基的显色探针,探针的3′末端的第1 个碱基是特异的,从第2~9 个碱基都是简并的,其中 C 或G 最后会被染成红色荧光,而A 或T 会被染成绿色荧光;

  C:以一个基因型为GT 的杂合子为例,芯片上的探针正好延长到SNP 位点前的一个碱基处,只有与目标DNA 片段完全互补,C 或A 碱基的显色探针才会被连接酶连接到捕获探针上。

  Affymetrix Axiom也在农作物育种领域设计研发了很多代表性芯片,如小麦660K、水稻50K、玉米50K和600K、大豆180K等。除了Illumina和Affymetrix外,Agilent的生物芯片也是很常用的。生物芯片系统比较类似,即由扫描仪、生物芯片、分析软件三部分组成,感兴趣的可去官网了解。尽管商业化的SNP芯片已经广泛应用于育种,但仍有以下不足:

  标记数量有限,难满足所有类型研究需求,如QTL精细定位;

  只能检测已知突变,无法检测新生突变;

  一般针对某些知名品种设计,与大多数研究的地方品种或闭锁群体的遗传距离较大,造成部分标记位点在特定群体中失效(如早期基于B73 和Mo17 这2个温带玉米自交系测序草图开发的SNP 芯片,无法识别出热带玉米基因组中的优异等位变异)。需要对特定品种特定群体进行芯片定制,提高了成本。SNP芯片简单介绍到这里,下节我们将继续了解全基因组水平的SNP分型策略——基因组重测序,包括简化基因组测序,它们在一定程度上弥补了高密度SNP芯片的不足。敬请期待。


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