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育种专栏 | 4-基因分型之固相芯片
前沿分享
2022-10-07
前面介绍到基因/SNP分型是现代分子育种的关键
SNP检测又有很多技术和方法
如基因芯片、简化基因组测序、重测序、靶向测序等
一种好的SNP分型方法应该兼顾了通量、成本、稳定性和灵活性等因素
因此小编计划介绍几种目前常见的SNP分型方法
本篇就先从 基因芯片 开始吧。
基因芯片简介
首次听到“基因芯片”的外行人很容易将其与工业上集成电路的电子芯片联系起来，实际上它们除了都利用缩微技术使得外观比较像以外，其他没什么关系，纯属碰瓷。基因芯片又称为DNA 芯片、生物芯片或DNA微阵列等，是根据分子间的特异性相互作用的原理，将不连续的分析过程集成于硅或玻璃等固相芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物成分的准确、快速、大量的检测。根据特定的科研应用内容，基因芯片可以细分为微阵列比较基因组杂交( a-CGH) 芯片、microRNA 芯片、SNP芯片、表达谱芯片、DNA甲基化芯片和染色质免疫共沉淀芯片等。
第一张商业化基因芯片在1996 年诞生。随着生物技术的发展，到目前为止，在生物分子检测和基因型鉴定领域，包含高密度分子标记或探针的生物芯片发挥着巨大作用，已广泛应用于医学检测与诊断、基因组学、遗传学和动植物育种。尤其是医学研究领域已经产生了大量的芯片数据，NCBI的GEO是目前最大的芯片数据库，也成了众多科研人员公共数据挖掘的重要来源。与传统的检测方法相比，基因芯片可以一次性固定数万个探针，从而检测数万个已知序列的相应信息。
SNP芯片技术就是将第3代SNP标记固定在载体上形成密集的寡核苷酸探针阵列，再与目标DNA 进行等位基因特异性反应，根据反应后信号的有无和强弱确定SNP位点的多态性，该技术可以对作物全基因组实现快速、高密度的扫描，特别是对育种工作中的大量群体样本进行基因型鉴定时，单个检测位点成本很低，是一种高集成、高通量、微型化和自动化的检测SNP的手段。SNP芯片依据自身高通量、自动化和高灵敏度等特点，被学术界和商业科研机构普遍认为具有重大的研究价值，也有很好的产业化趋势。知名商业化公司如ThermoFisher、Agilent、Illumina、Affymetrix(已被ThermoFisher收购，为了更好区分，此处仍以Affymetrix为名)等，其中Illumina的Infinium技术和Affymetrix的Axiom技术应该是目前较为流行的高密度SNP芯片解决方案，所以这里重点介绍一下这两项技术。
Illumina Infinium BeadChip
Illumina的生物芯片系统主要由芯片、扫描仪和分析软件组成。而芯片则由玻璃基片和微珠两部分组成。
Illumina Infinium芯片是基于微珠的 BeadArray生物芯片，首先在玻璃基片(称为Wafer)上，通过光蚀刻的方法蚀刻出许多个排列整齐的小孔，每个小孔直径约为3 μm，这些小孔刚好可以容纳一个微珠。微珠是芯片的核心部分，每个微珠的表面偶联了几十万条相同序列的DNA 片段。这些DNA片段的长度是73个碱基，分成2个功能区域，靠近珠子一侧的23 个碱基的序列被称为Address 序列，是标识微珠的标签序列，相当于微珠的身份证号码(ID 号);远离珠子端的50 个碱基被称为探针序列，是针对某一个特定的SNP 位点设计的，作用是与目标DNA 进行互补杂交。Address 序列与探针序列之间是一一对应的关系。
在Illumina 芯片生产过程中，把几十万种微珠按设定的比例混合好，撒到玻璃基片上，微珠随机落入基片的小孔中，通过检测微珠上DNA 片段单碱基延伸时所掺入的dNTP 上所带的荧光信号来区别不同的基因型。
图片说明：
A：在玻璃基片上光蚀刻出直径约为3 μm 的整齐小孔，每个小孔刚好可以容纳一个微珠;
B：微珠表面偶联了几十万条相同序列的DNA 片段，靠近珠子一侧的23nt 序列是用于标识微珠的Address 序列，而远离珠子端的50nt 序列是待测SNP 位点特异性的探针序列;
C：用绿色荧光标记C 碱基，用红色荧光标记T 碱基，以基因型为CT 的SNP 为例，如果发出的光为绿色，则是CC 纯合子，如果发出的光为红色，则为TT 纯合子，如果绿色和红色荧光都有，而且光强度差不多，那么该位点则是CT 杂合子。
Illumina的SNP芯片具有如下优势：
检测通量大，一次可以检测几十万到几百万个SNP位点;
检测准确性高，可以达到99.9%以上;
检测的费用相对低廉，大约一个90万位点的芯片(每个样本的)检测费用在一两千元。在农作物育种方面，Illumina Infinium BeadChip技术已经设计研发出大量SNP芯片，如水稻6K、玉米50K和3K、小麦9K和90K、大麦的9K等。
Affymetrix AxiomAffymetrix 公司主要有GeneAtlas、7G、DX2和GeneTitan四种机型，应用最广的两种生物芯片是表达谱芯片和SNP分型芯片。SNP芯片制作也是通过“光蚀刻”完成的，即在一张大的玻璃基片上合成DNA 探针，探针的3′端固定到玻璃基片上，相同序列的探针都是针对同一个SNP 设计的。
Affymetrix Axiom 分型芯片是基于连接反应进行基因型检测：首先设计4 套显色探针，A、C、G、T 各一组，这些探针长度都是9 个碱基，其中只有3′末端的第1 个碱基是特异的，从第2 个碱基到第9 个碱基都是简并的;3′端是C或G碱基的探针的5′端带有一个生物素标签，最后会被染成红色荧光;3′端是A 或T 碱基的探针的5′端带另外一种标签，最后会被染成绿色荧光。
以一个基因型为GT 的SNP 位点为例，先设计这个SNP 位点的特异性探针(通过羟基连接在芯片上，也称为“捕获探针”)，该探针正好延长到SNP 位点旁边的一个碱基处;当样本DNA 经过变性后，单链DNA 会与捕获探针退火杂交;再加入4 种显色探针，通过连接酶进行连接，因为连接酶对连接位点前后几个碱基进行精确识别，所以只有与目标DNA 片段完全互补的显色探针才会被连接酶连接到捕获探针上去;连接反应完成后，将游离的显色探针洗掉，再用带荧光标记的染色试剂进行染色;最后，在激光扫描仪中对芯片进行扫描，扫描过程中，如果看到该探针上所发出的光是单纯红色，就可以判断这个位点的SNP 型是GG 型纯合子;如果发出的荧光是单纯的绿光，那么就可以判断这个SNP 是TT 型纯合子;如果发出的光，既有红光又有绿光，而且红光和绿光的光强差不多，则可以判断这个SNP 位点是GT 的杂合子。
图片说明：
A：在一张大的玻璃基片上直接合成DNA 探针，探针的3′端固定在玻璃基片上;
B：设计A、T、C、G 4 种碱基的显色探针，探针的3′末端的第1 个碱基是特异的，从第2~9 个碱基都是简并的，其中 C 或G 最后会被染成红色荧光，而A 或T 会被染成绿色荧光;
C：以一个基因型为GT 的杂合子为例，芯片上的探针正好延长到SNP 位点前的一个碱基处，只有与目标DNA 片段完全互补，C 或A 碱基的显色探针才会被连接酶连接到捕获探针上。
Affymetrix Axiom也在农作物育种领域设计研发了很多代表性芯片，如小麦660K、水稻50K、玉米50K和600K、大豆180K等。除了Illumina和Affymetrix外，Agilent的生物芯片也是很常用的。生物芯片系统比较类似，即由扫描仪、生物芯片、分析软件三部分组成，感兴趣的可去官网了解。尽管商业化的SNP芯片已经广泛应用于育种，但仍有以下不足：
标记数量有限，难满足所有类型研究需求，如QTL精细定位;
只能检测已知突变，无法检测新生突变;
一般针对某些知名品种设计，与大多数研究的地方品种或闭锁群体的遗传距离较大，造成部分标记位点在特定群体中失效(如早期基于B73 和Mo17 这2个温带玉米自交系测序草图开发的SNP 芯片，无法识别出热带玉米基因组中的优异等位变异)。需要对特定品种特定群体进行芯片定制，提高了成本。SNP芯片简单介绍到这里，下节我们将继续了解全基因组水平的SNP分型策略——基因组重测序，包括简化基因组测序，它们在一定程度上弥补了高密度SNP芯片的不足。敬请期待。
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